Dernière modification : jeudi 26 février.

Détection des micro ARN chez l'humain

Modalités de remise

Ce devoir est le deuxième d'une série de 3 devoirs, dont les deux meilleurs seront pris en comptes lors de la note finale (25% chacun).

La date de remise est le 10 mars. Les documents à remettre consistent en un rapport d'au plus une dizaine de pages, et en un ensemble de fichier d'analyse, que vous pouvez me transmettre soit par courriel, soit en les déposant sur votre compte Unix des machines du labo du DESS.

Introduction au travail

Le but de ce travail est d'étudier le problème de la prédiction, chez l'humain, d'une famille assez populaire(1) d'ARN non codants, les micro-ARNs (en anglais miRNAs), et de se familiariser avec les notions de repliement par minimisation d'énergie et de recherche de motifs de structure secondaire.

Les miRNAs prennent la forme de séquences d'une vingtaine de nucléotides que l'on retrouve en particulier dans des séquences introniques de taille 70-100 nucléotides pouvant se replier en un motif stem-loop (aussi appelé hairpin-like), que l'on appelle le précurseur (pre-miRNA).

Une base de données dédiée aux miRNAs a été publiée récemment : The miRNA Registry.

(1) Tapez les mot miRNA ou microRNA dans Entrez-PubMed et vous aurez une idée de l'intérêt des chercheurs pour ces gènes. Un bon article de revue aussi : The microRNA world: small is mighty.

Question 1.

Dans cette question, nous allons nous intéresser à quelques miRNAs présents dans le génome humain, et aux propriétés de leur repliement par minimisation d'énergie avec MFOLD (la version originale de ce programme, ainsi que plusieurs variantes, est disponible en RNA & DNA Folding Applications).

Le travail demandé consiste à analyser le repliement d'une dizaine de séquences de pre-miRNAs provenant de 2 chromosomes du génome humain. Selon The miRNA Registry, les miRNAs se répartissent comme suit (je n'ai mis qu'un sous-ensemble des chromosomes pour des raisons d'espace) :

chromosome 1 : 34, 181-b, 213, 214, 215.
chromosome 2 : 10-b, 26-b, 216, 217.
chromosome 3 : 16-3, 26-a, 28, 128-b.
chromosome 6 : 30, 133-b, 219.
chromosome 7 : 25, 29, 291b-2.
chromosome 9 : 7-1, 31, 32, 24-1, 199-b.
chromosome 13 : 15-a, 16, 17, 18, 19-a, 19-b-1, 20.
chromosome 17 : let-7a-1, let-7d, let-7f-1, 10-a, 33-b, 108-1, 212.
chromosome 19 : let-7e, 7-3, 23, 24-2, 27, 181-c.
chromosome 22 : let-7a-3, let-7b, 33, 130-b.
chromosome X : let-7f-2, 19-b-2, 106, 220, 221, 222, 223.

Le but est de faire une étude la plus complète possible de ces repliements par minimisation d'énergie, pour la dizaine de pre-miRNAs que vous aurez choisis, étant donné que vous connaissez les vraies structures par The miRNA Registry. En particulier, les questions suivantes sont intéressantes :

quels types d'éléments structurels sont bien prédits ?
quelle est la distribution des valeurs énergétiques ?
tout ce que vous pourrez tirer de ces repliements et de MFOLD.

Remarque. Envoyez-moi par courriel ou déposez sur votre compte Unix des machines du labo du DESS les résultats de vos analyses de repliement.

CORRIGÉ.

Vous êtes tous arrivés à une conclusion similaire.

Dans l'ensemble MFOLD prédit assez bien les structures secondaires des pre-miRNAs.
Les principales erreurs correspondent à deux types de motifs de structure secondaire :
- les grandes boucles terminales, qui sont coupés en deux boucles, comme par exemple le pre-miRNA hsa-let-7d, dont voici l'entrée du miRNA Registry et la prédiction MFOLD (structure et décomposition énergétique) ;
- plus surprenant, un certain nombre de petites boucles internes séparées par une paire de base sont fusionnées en une seule boucle, comme par exemple chez hsa-mir-223 ( structure connue, structure MFOLD, décomposition énergétique,
- La structure d'énergie minimum n'est pas toujours la plus proche de la structure connue, comme par exemple avec hsa-mir-130b, dont voici la structure optimale et la seconde structure optimale.
Finalement, l;a distribution des paramètres énergétiques ne montre pas de grande coorélation avec la qualité de la prédiction de MFOLD, même si on la pondère par la longueur des équences considérées. On a une bonne illustration de ce fait en examinant les ARN hsa-mir-18, hsa-mir-19a, hsa-mir-15a, hsa-mir-16-1, hsa-mir-221 et hsa-mir-222.

Question 2.

Dans cette courte question, j'aimerais que vous repreniez les séquences des pre-miRNAs que vous avez étudiés et qu'à l'aide du service BLAST, vous étudiiez la spécificité, en terme de similarité de séquence, de ces pre-miRNAs vis-à-vis du clade des Mammifères. Les résultats obtenus laissent-ils supposer qu'une analyse à base de covariation (par exemple avec MatrixPlot) pourrait aider à prédire ces gènes ? Les régions similaires que vous trouvez ainsi dans les autres génomes de mammifères correspondent-elles en général des pre-miRNAs ?

Remarque. Envoyez-moi par courriel ou déposez sur votre compte Unix des machines du labo du DESS les résultats de vos BLAST.

CORRIGÉ.

Là encore vous avez à peu près tous remarqué les faits suivants :

On retrouve peu de hits BLAST vers des pre-miRNAs, et plutôt de nombreux hits soit vers des séquences de miRNAs matures (notamment humain et souris), soit vers des séquences dont l'annotation ne mentionne aucun lien avec des miRNAs.
Les quelques hits intéressants que l'on retrouve ne présentent pas assez de variabilité pour espérer utiliser la technique d'analyse de covariation.

Par exemple, un Blast chez les mammifères avec les pre-miRNAs hsa-mir-222 et hsa-let-7a-1 donnent les résultats suivants :

Or pour pouvoir effectuer une analyse de covariation, même pour un seul pre-miRNA, il faudrait disposer des éléments suivants :

un ensemble suffisamment grand (au moins 6,7 séquences) de pre-miRNAs de fonction similaire mais chez d'autres espèces (rat, souris, ...),
un alignement de ces séquences tenant compte des éléemnts de structure secondaire et exhibant suffisamment de covariations (paires de bases appareilléees variant ensemble).

Or, outre le fait que peu de hits Blast concernent des pre-miRNAs, Blast n'intègre aucune information structurelle dans son alignement. Une solution pour résoudre (peut-être) ce problèmeconsisterait à essayer le programme FoldAlign (et son complément naturel Slash) mais il faudrait pour cela auparavant avoir un ensemble de séquences reliées, ce qui ne paraît pas évident au vu de vos résultats).

Par exemple, dans l'un de vos devoirs, les 10 pre-miRNAs testés ont engendré 389 hits, dont 30 nouveaux miRNAs (dans ce cas, il faut aussi récupérer la séquence précurseur) ou pre-miRNAs, mais une analyse de l'alignement de ces séquences avec MatrixPlot n'a montré aucun résultat intéressant du point de vue de la covariation. Pour information, voici les résultats de ce devoir : résultats Blast.

Question 3.

Le but de cette question est d'étudier la possibilité de repérer les pre-miRNA à l'aide du programmes PatSearch de recherche de motifs de structures secondaires dans une séquence.

Votre travail consiste en deux étapes :

à partir des pre-miRNAs que vous avez étudiés jusque-là, essayez de définir un (ou des) motif(s) (au sens de PatSearch) consensus pour leur structure secondaire ;
rechercher ce motif sur les régions conservées des deux chromosomes du génome humain que vous avez étudiés(2) :
- retrouvez-vous toutes les occurrences des mi-RNAs dont on disposait au début de l'étude ?
- si non, est-ce parce que la séquence correspondante n'est pas présente dans les fichiers que je vous fournis ou parceque votre (ou vos) motif(s) est trop spécifique à un ou des pre-miRNAs?
- trouvez-vous de nombreux autres miRNAs possibles dans ces deux chromosomes avec votre recherche de motifs ?

CORRIGÉ.

Cette question a posé problème du fait des défaillances du serveur PatSearch. Néammoins, vous avez tous essayé diverses stratégies de mise au point de motifs (allant de motifs très simples à des motifs plus complexes), sans qu'aucune d'entre elle ne soit trè efficace.

La meilleure stratégie que l'on retrouve consistait à essayer de définir un motif pour une série de quelques pre-miRNAs caractérisés par des décompositions en suites de (petite boucle, hélice), avant la boucle terminale, relativement similaire, ce motif étant rendu plus sensible par l'utilisation de mismatchs (paramètres [x,y,z] des motifs).

(2) Vous pouvez récupérer ici un ensemble de fichiers FASTA (fournis par Mathieu Blanchette) contenant les régions conservées des chromosomes qui nous intéressent dans le dernier assemblage du génome humai Ces données sont éclatées en fichiers d'au plus 2 MegaOctets chacun et compressées avec gzip (on peut les décompresser avec gunzip).

Remarque. Envoyez-moi par courriel ou déposez sur votre compte Unix des machines du labo du DESS la description de votre motif et les résultats de PatSearch.

Question Bonus.

La question sous-jacente à la Question 3 est en fait la suivante : est-il possible de définir un seul motif consensus pour les pre-miRNAs ? À mon avis, la réponse est non, mais peut-être plusieurs motifs permettraient-ils d'être plus efficaces : si vous avez le temps, vous pouvez tester cette hypothèse.

Toujours pour la question 3, vous pouvez reprendre quelques une des séquences obtenues par PatSearch et ne correspondant pas à des pre-miRNAs et refaire l'expérience de la Question 2 : trouvez-vous des séquences similaires chez le mammifères ? L'alignement que vous obtenez ressemble-t'il aux alignements de pre-miRNAs ?